Detección de Acido Nucleico de Virus
Se conocen las secuencias genómicas de la mayoría de los virus. Sondas de ácido nucleico que son segmentos cortos de ADN diseñados para hibridar con segmentos de ADN o ARN víricos complementarios. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica más eficaz para la detección viral. Recientemente se han desarrollado métodos de diagnóstico de alto rendimiento.
A. Técnica de hibridación de ácidos nucleicos
La hibridación de ácidos nucleicos, que incluye principalmente la transferencia Southern (Southern) y la transferencia Northern (Northern), es una nueva técnica de rápido desarrollo en el campo del diagnóstico de virus. La razón fundamental del ensayo de hibridación es utilizar segmentos cortos de ADN （llamados "sonda"） diseñados para hibridar con segmentos de ADN o ARN víricos complementarios. Mediante calentamiento o tratamiento alcalino, el ADN o ARN diana de doble hebra se separa en hebras simples y luego se inmovilizan sobre un soporte sólido. Después de eso, se agrega la sonda y se hibrida con el ADN o ARN diana. Como la sonda está marcada con un isótopo o un nucleido no radiactivo, el ADN o ARN diana se puede detectar mediante autorradiografía o mediante el sistema biotina-avidina. Dado que la mayoría de los genomas virales se han clonado y secuenciado, se pueden detectar utilizando secuencias específicas del virus como sondas en la muestra. Actualmente, los métodos de hibridación incluyen: dot blot, hibridación in situ en células, transferencia de ADN (ADN) (transferencia Southern) y transferencia de ARN (ARN) (transferencia Northern).
B. Tecnología PCR
En los últimos años se ha desarrollado una serie de técnicas de amplificación de ácidos nucleicos in vitro basadas en PCR, para ensayar virus insensibles o no cultivables. La PCR es un método que puede sintetizar una secuencia de ADN específica mediante una reacción de polimerasa in vitro. El proceso de PCR incluye un ciclo térmico de tres pasos: desnaturalización, hibridación y extensión. A alta temperatura (93 ~ 95 ℃), el ADN bicatenario se separa en dos cadenas simples de ADN; luego, a baja temperatura (37 ℃ ~ 60 ℃), dos cebadores de nucleótidos sintetizados se aparean con los segmentos de ADN complementarios; mientras que a la temperatura apropiada para la enzima Taq (72 ℃), la síntesis de nuevas cadenas de ADN comienza desde el extremo del cebador 3 'utilizando ADN complementario como plantillas y nucleótidos simples como materiales. Entonces, después de cada ciclo, una cadena de ADN se puede amplificar en dos cadenas. Repitiendo este proceso, cada cadena de ADN sintetizada en un ciclo se puede utilizar como plantilla en el siguiente ciclo, y el número de cadenas de ADN se duplica en cada ciclo, lo que significa que la producción de PCR se amplifica a una velocidad logarítmica de 2n. Después de 25 a 30 ciclos, la producción de PCR se identifica mediante electroforesis y los productos de ADN específicos se pueden observar bajo luz ultravioleta (254 nm). Por su ventaja de especificidad, sensibilidad y conveniencia, la PCR se ha adoptado en el diagnóstico clínico de muchas infecciones virales como el VHC, el VIH, el CMV y el VPH. Como la PCR es muy sensible, puede detectar el ADN del virus a nivel de fg, la operación debe realizarse con mucho cuidado para evitar falsos positivos. Además, un resultado positivo en la prueba de ácido nucleico no significa que haya un virus infeccioso vivo en la muestra.
Con una amplia aplicación de la técnica de PCR, se desarrollan nuevas técnicas y métodos basados en la técnica de PCR para diferentes propósitos de prueba. Por ejemplo, la PCR cuantitativa en tiempo real puede detectar la carga viral; La PCR in situ se utiliza para identificar la infección por virus en tejidos o células; La PCR anidada puede aumentar la especificidad de la PCR. Entre ellos, la PCR cuantitativa en tiempo real se ha desarrollado con mayor rapidez. Muchas técnicas nuevas, como la sonda de hidrólisis TaqMan, la sonda de hibridación y la sonda de baliza molecular, se han combinado en la técnica de PCR cuantitativa en tiempo real, que se utiliza ampliamente en la investigación clínica. Además de identificar con precisión la carga viral en los fluidos corporales de los pacientes, este método también se puede utilizar para detectar mutantes tolerantes a fármacos. Por lo tanto, la PCR cuantitativa en tiempo real se aplica principalmente en la evaluación del efecto curativo y la vigilancia de la tolerancia a los medicamentos.
C.Detección de alto rendimiento de ácidos nucleicos virales
Para satisfacer las necesidades de diagnóstico rápido de nuevas enfermedades infecciosas emergentes, se han establecido varios métodos de detección de alto rendimiento, como chips de ADN (ADN). Para los chips de ADN, se sintetizan sondas específicas y se unen a pequeños chips de silicio de muy alta densidad para formar un microarray de sondas de ADN (ADN) que se pueden hibridar con la muestra. La señal de hibridación puede obtenerse mediante un microscopio confocal o un escáner láser y procesarse posteriormente por la computadora y se puede obtener un enorme conjunto de datos sobre diferentes genes. Hay dos tipos de chips de ADN. El "chip de síntesis" es el siguiente: los oligonucleótidos específicos se sintetizan directamente en los chips. Otro es el chip pool de ADN. Los genes o productos de PCR clonados se imprimen ordenadamente en el portaobjetos. La ventaja de la tecnología de chips de ADN es la detección simultánea de una gran cantidad de secuencias de ADN. La última versión del chip de detección de patógenos puede identificar más de 1700 virus humanos a la vez. La tecnología de chips de ADN resolvió los problemas de los métodos tradicionales de hibridación de ácidos nucleicos y tiene aplicaciones muy amplias en el diagnóstico viral y el estudio epidemiológico.