Détection des acides nucléiques viraux

Les séquences génomiques de la plupart des virus sont connues. Sondes d'acide nucléique qui sont de courts segments d'ADN conçus pour s'hybrider avec des segments d'ADN ou d'ARN viraux complémentaires. La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une technique plus efficace pour la détection virale. Des méthodes de diagnostic à haut débit ont été développées récemment.

A. Technique d'hybridation d'acide nucléique

L'hybridation d'acide nucléique, comprenant principalement le Southern blot (Southern) et le Northern blot (Northern), est une nouvelle technique en développement rapide dans le domaine du diagnostic des virus. La justification du test d'hybridation est d'utiliser de courts segments d'ADN (appelés «sonde») conçus pour s'hybrider avec des segments d'ADN ou d'ARN viraux complémentaires. Par chauffage ou traitement alcalin, l'ADN ou l'ARN cible double brin sont séparés en simples brins puis sont immobilisés sur un support solide. Après cela, la sonde est ajoutée et hybridée avec l'ADN ou l'ARN cible. Comme la sonde est marquée avec un isotope ou un nucléide non radioactif, l'ADN ou l'ARN cible peut être détecté par autoradiographie ou par le système biotine-avidine. Étant donné que la plupart des génomes viraux ont été clones et séquencés, ils peuvent être détectés en utilisant des séquences spécifiques au virus comme sondes dans l'échantillon. Actuellement, les méthodes d'hybridation comprennent: le dot blot, l'hybridation in situ dans les cellules, le transfert d'ADN (ADN) (Southern blot) et le transfert d'ARN (ARN) (Northern blot).

B. Technologie PCR

Ces dernières années, une série de techniques d'amplification d'acide nucléique in vitro a été développée sur la base de la PCR, pour tester des virus insensibles ou incultes. La PCR est une méthode qui peut synthétiser une séquence d'ADN spécifique par réaction de polymérase in vitro. Le processus de PCR comprend un cycle thermique en trois étapes: dénaturation, hybridation et extension À haute température (93 ℃ ~ 95 ℃), l'ADN double brin est séparé en deux brins d'ADN simples; puis à basse température (37 ℃ ~ 60 ℃), deux amorces nucléotidiques synthétisées s'hybrident aux segments d'ADN complémentaires; tandis qu’à la température appropriée pour l’enzyme Taq (72 ℃), la synthèse de nouvelles chaînes d’ADN commence à partir de l’amorce 3 en utilisant l’ADN complémentaire comme matrice et les nucléotides uniques comme matériaux. Ainsi, après chaque cycle, une chaîne d'ADN peut être amplifiée en deux chaînes. En répétant ce processus, chaque chaîne d'ADN synthétisée en un cycle peut être utilisée comme matrice dans le cycle suivant, et le nombre de chaînes d'ADN est doublé à chaque cycle, ce qui signifie que la production de PCR est amplifiée à une vitesse logarithmique de 2n. Après 25 à 30 cycles, la production de PCR est identifiée par électrophorèse, et les produits d'ADN spécifiques peuvent être observés sous lumière UV (254 nm). Pour son avantage de spécificité, de sensibilité et de commodité, la PCR a été adoptée dans le diagnostic clinique de nombreuses infections virales telles que le VHC, le VIH, le CMV et le HPV. Comme la PCR est très sensible, elle peut détecter l'ADN du virus au niveau fg, l'opération doit être effectuée très soigneusement pour éviter les faux positifs. De plus, un résultat positif au test d'acide nucléique ne signifie pas qu'il y a un virus infectieux vivant dans l'échantillon.

Avec une large application de la technique PCR, de nouvelles techniques et méthodes sont développées sur la base de la technique PCR à des fins de test différentes. Par exemple, la PCR quantitative en temps réel peut détecter la charge virale; la PCR in situ est utilisée pour identifier une infection virale dans les tissus ou les cellules; La PCR imbriquée peut augmenter la spécificité de la PCR. Parmi eux, la PCR quantitative en temps réel a été développée plus rapidement. De nombreuses nouvelles techniques, telles que la sonde d'hydrolyse TaqMan, la sonde d'hybridation et la sonde de balise moléculaire, ont été combinées dans une technique de PCR quantitative en temps réel, largement utilisée dans la recherche clinique. Outre l'identification précise de la charge virale dans le liquide corporel des patients, cette méthode peut également être utilisée pour détecter un mutant tolérant aux médicaments. Par conséquent, la PCR quantitative en temps réel est principalement appliquée à l'évaluation des effets curatifs et à la surveillance de la tolérance aux médicaments.

C. Détection à haut débit des acides nucléiques viraux

Pour répondre aux besoins de diagnostic rapide des nouvelles maladies infectieuses émergentes, diverses méthodes de détection à haut débit, comme les puces à ADN (ADN), ont été mises en place. Pour les puces à ADN, des sondes spécifiques sont synthétisées et attachées à de petites puces de silicium à très haute densité pour former une puce à ADN (ADN) qui peut être hybridée avec un échantillon. Le signal d'hybridation peut être imagé par un microscope confocal ou un scanner laser et être ensuite traité par l'ordinateur et un énorme ensemble de données concernant différents gènes peut être obtenu. Il existe deux types de puces à ADN. La «puce de synthèse» est la suivante: les oligonucléotides spécifiques sont synthétisés directement sur les puces. Un autre est la puce de pool d'ADN. Les gènes clones ou les produits de PCR sont imprimés de manière ordonnée sur la lame. L'avantage de la technologie des puces à ADN est la détection simultanée d'une énorme quantité de séquences d'ADN. La dernière version de la puce de détection des agents pathogènes peut identifier plus de 1700 virus humains à la fois. La technologie des puces à ADN a résolu les problèmes des méthodes traditionnelles d'hybridation d'acide nucléique et a des applications très larges dans le diagnostic viral et l'étude épidémiologique.